近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院曹慧團(tuán)隊(duì)在《Journal of Hazardous Materials》上發(fā)表了題為“Discovery of a polyester polyurethane-degrading bacterium from a coastal mudflat and identification of its degrading enzyme”的研究論文(DOI: 10.1016/j.jhazmat.2024.136659)。該研究從沿海灘涂中分離出一種高效降解聚氨酯（PU）的細(xì)菌Aeromicrobium sp. LTX1，并通過紫外線誘變獲得其突變株MLTX1。研究發(fā)現(xiàn)，MLTX1在4天內(nèi)可降解86%的PU泡沫，遠(yuǎn)超現(xiàn)有報(bào)道的微生物降解效率。此外，研究還通過多組學(xué)方法鑒定出一種新型角質(zhì)酶PurH，該酶在大腸桿菌中表達(dá)后能有效降解PU泡沫。這一發(fā)現(xiàn)為PU塑料的生物降解和回收提供了新的科學(xué)依據(jù)和潛在生物催化資源。
研究背景
聚氨酯（PU）是一種由多元醇和異氰酸酯合成的聚合物，因其優(yōu)異的隔熱和機(jī)械性能，廣泛應(yīng)用于汽車、建筑、醫(yī)療和紡織品等領(lǐng)域。根據(jù)歐洲塑料協(xié)會（2023年）的數(shù)據(jù)，PU是全球第六大最常用的塑料，占全球塑料產(chǎn)量的5.3%，約4億噸。然而，PU的廣泛使用導(dǎo)致大量固體廢棄物的產(chǎn)生，且由于缺乏有效的回收機(jī)制，大多數(shù)PU廢棄物最終被填埋或焚燒。填埋場中的PU廢棄物自然分解緩慢，可能需數(shù)千年，并影響土壤pH值；焚燒則會產(chǎn)生有毒氣體和重金屬，造成生態(tài)毒性。近年來，PU的生物降解作為一種環(huán)保的回收方法迅速發(fā)展，能夠減少填埋空間并生成水、二氧化碳和生物質(zhì)。已有研究表明，某些微生物如銅綠假單胞菌A12和枯草芽孢桿菌MZA-75等能夠有效降解PU，但固體PU的降解效率仍較低，主要因其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)和成分。盡管已有大量研究，PU生物降解的機(jī)制仍不明確，尤其是針對其軟鏈段和硬鏈段的降解。酯酶在軟鏈段降解中起關(guān)鍵作用，而硬鏈段的降解則更為困難，盡管某些酶如木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶顯示出降解氨基甲酸酯鍵的潛力。因此，發(fā)現(xiàn)新的高效酶或通過酶工程提高其催化效率，以實(shí)現(xiàn)PU的完全降解和回收，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。本研究旨在分離和表征一種高效降解PU的細(xì)菌LTX1，并通過多組學(xué)方法鑒定關(guān)鍵降解酶。
圖文導(dǎo)讀
圖1. 菌株LTX1和MLTX1的分離與鑒定及其降解PU塑料的能力評估
研究團(tuán)隊(duì)從沿海泥灘的樣品中分離出11株細(xì)菌，通過PU泡沫降解實(shí)驗(yàn)篩選出降解效率最高的菌株LTX1，并利用紫外線誘變技術(shù)獲得了降解效率更高的突變株MLTX1。MLTX1菌株在平板上產(chǎn)生的透明區(qū)直徑大于LTX1菌株，表明其具有更強(qiáng)的PU降解能力。通過16S rRNA基因序列分析，兩株菌株與Aeromicrobium sp. HA高度相似，結(jié)合形態(tài)學(xué)和遺傳特征，最終將其鑒定為氣微菌屬。
在降解實(shí)驗(yàn)中，MLTX1菌株表現(xiàn)出顯著的PU泡沫降解能力。經(jīng)過2天的培養(yǎng)，MLTX1處理的聚酯-PU泡沫開始崩解，4天后完全降解為粉末，而LTX1菌株則需要12天才能達(dá)到相同的降解水平。定量分析顯示，LTX1菌株在14天內(nèi)對PU泡沫的降解效率達(dá)到86.52%，而MLTX1菌株僅需4天即可達(dá)到相同的降解效果。此外，MLTX1菌株對多種PU塑料的降解效率均顯著高于LTX1菌株，但在硬質(zhì)PU和聚醚基PU的降解上表現(xiàn)相對較弱。
圖2. LTX1和MLTX1處理4天后PU泡沫的降解評估。
通過掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜分析了菌株LTX1和MLTX1對聚氨酯泡沫的降解效果。結(jié)果顯示，LTX1處理的PU泡沫表面變得粗糙且不均勻，出現(xiàn)裂縫和空隙，而MLTX1處理的PU泡沫僅出現(xiàn)微小碎片。FTIR光譜顯示，菌株分泌的酶水解了PU泡沫中的酯鍵和氨基甲酸酯鍵。熱重分析表明，MLTX1處理的PU泡沫在更高溫度下開始分解，并表現(xiàn)出更高的降解速率。以上結(jié)果說明MLTX1在降解PU泡沫方面表現(xiàn)出更高的效率。
圖3. LTX1、MLTX1及模式菌株Aeromicrobium sp. HA的基因組分析
通過對LTX1菌株及其突變菌株MLTX1的基因組進(jìn)行測序和比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們的基因組相對于基準(zhǔn)菌株Aeromicrobium sp. HA顯著增大。在LTX1和MLTX1基因組中鑒定出的PurH基因，與具有PU降解活性的Thermomonospora curvata DSM43183水解酶具有63.24%的同源性。盡管核苷酸序列相似性適中，但PurH蛋白展現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)一致性，揭示了α/β水解酶折疊的存在，表明其在PU降解中可能發(fā)揮重要作用。
圖4. LTX1和 MLTX1的差異表達(dá)基因分析
通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LTX1和MLTX1菌株之間存在顯著差異基因表達(dá)，特別是MLTX1中PurH基因顯著上調(diào)。GO和KEGG分析揭示了與細(xì)胞成分、代謝調(diào)節(jié)及RNA生物合成相關(guān)的上調(diào)途徑，可能解釋了PurH高表達(dá)的原因。KEGG通路中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氧化磷酸化和群體感應(yīng)顯著變化，說明MLTX1可能通過感知環(huán)境并分泌大量PurH酶到細(xì)胞外間隙來增強(qiáng)PU降解。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了主要差異表達(dá)基因的可重復(fù)性，特別是PurH在MLTX1中的高表達(dá)，強(qiáng)調(diào)了其在提高降解效率中的關(guān)鍵作用。
圖5. PurH 酶的表達(dá)、純化和驗(yàn)證
通過克隆PurH基因至pET29a（+）載體并在T7啟動子控制下表達(dá)，獲得了PurH水解酶。該酶在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，并在平板上展現(xiàn)出清晰的透明降解區(qū)域，表明其具有降解PU的能力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，PurH酶能完全水解PU泡沫，導(dǎo)致顯著重量損失。這些結(jié)果證實(shí)了從LTX1和MLTX1菌株中克隆的PurH基因在PU生物降解過程中的關(guān)鍵作用。
主要結(jié)論
本文成功分離出高效PU降解菌株Aeromicrobium sp. LTX1及其突變株MLTX1，兩者在降解測試中分別使PU泡沫重量損失高達(dá)86%。通過SEM、FTIR和TGA分析證實(shí)，這些菌株能分泌特異性酶催化PU泡沫酯鍵和氨基甲酸酯鍵的水解。特別的是，PurH酶在降解中起關(guān)鍵作用，且在MLTX1中轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著增高。本研究不僅深化了對PU塑料生物降解分子機(jī)制的理解，還為新型生物降解技術(shù)開發(fā)和PU材料可持續(xù)利用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和潛在生物催化資源。
